Imuno-histoquímica: Princípios e Aplicações no Diagnóstico e na Pesquisa (Minicurso IntegraVet 2025)
ATENÇÃO: O conteúdo deste site pertence à Universidade Federal de Viçosa
Data: 11 de setembro
Horário: 8:00 às 12:00
Local: Laboratório de Microscopia, DVT/UFV
Equipe:
Elaine Nery de Araújo
Eugênio Scolforo Louzada
Fabrício Luciani Valente
Contato: fabriciovalente@ufv.br
Bem-vinda(o)!
Este minicurso aborda técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) para diagnóstico e pesquisa. Aqui você encontrará protocolos detalhados, princípios teóricos e dicas práticas para executar ensaios com segurança e precisão.
1. Orientações Gerais
O que levar: Jaleco limpo e roupas adequadas. Luvas descartáveis serão fornecidas.
Comportamento e organização: Manter bancada organizada; evite alimentos, bebidas e celulares.
Segurança: Trabalhe com atenção, siga normas de biossegurança e higienize as mãos antes e depois das atividades.
2. Princípios da IHQ
A IHQ detecta proteínas específicas em cortes histológicos de tecido usando anticorpos. Com base nas propriedades de ligação entre antígeno e anticorpo, a técnica é capaz de indicar onde a proteína é expressa e com qual intensidade. Por ser uma técnica associada à histologia, é possível identificar os tipos celulares especificamente envolvidos em um dado processo fisiológico.
Componentes-base da técnica
Anticorpo primário: Reconhece o antígeno alvo.
Anticorpo secundário: Conjugado a enzima (HRP, AP) para revelar a ligação.
Substrato cromogênico: Produz sinal colorimétrico visível.
Tipos de IHQ
Indireta: usa anticorpo secundário.
Direta: anticorpo primário já conjugado.
Multiplex: detecta mais de um antígeno simultaneamente.
3. Exemplo de Protocolo (Resumo Visual)
- Preparação do tecido: cortes, desparafinização, reidratação.
- Recuperação antigênica (quando necessário).
- Bloqueio de peroxidase endógena.
- Bloqueio de ligação inespecífica.
- Incubação com anticorpo primário.
- Incubação com anticorpo secundário.
- Revelação com DAB.
- Contracoloração (hematoxilina).
- Montagem e análise microscópica.
4. Interpretação de resultados
- Avalie intensidade e padrão da imunomarcação.
- Localize a marcação: qual tipo celular? que estrutura (núcleo, citoplasma, membrana, matriz)?
- Controle positivo: deve estar marcado nitidamente com a marcação.
- Controle negativo: garante especificidade; não deve apresentar a marcação.
- Observações qualitativas e quantitativas (percentual de células positivas, localização subcelular).
5. Dicas Práticas
- Evite dobras e bolhas do corte.
- Use ponteiras filtradas e ajuste corretamente volumes/diluições.
- Siga tempos e temperaturas rigorosamente.
- Armazene anticorpos conforme instruções do fabricante.
7. Glossário
AP (Alcalina Fosfatase)
Definição: Enzima conjugada a anticorpo secundário, alternativa à HRP.
Observação: Requer substratos específicos, como NBT/BCIP.
Anticorpo monoclonal
Definição: Reconhece um único epítopo do antígeno.
Observação: Alta especificidade; menor risco de reatividade cruzada.
Anticorpo policlonal
Definição: Reconhece múltiplos epítopos de um antígeno.
Observação: Maior sensibilidade, porém mais risco de reações inespecíficas.
Anticorpo primário
Definição: Reconhece especificamente o antígeno alvo.
Observação: Deve ser compatível com a espécie do tecido; monoclonal ou policlonal dependendo da necessidade.
Anticorpo secundário
Definição: Reconhece o anticorpo primário e é conjugado a uma enzima ou fluoróforo.
Observação: Sempre escolha um anticorpo anti-IgG da espécie do primário; amplifica o sinal.
Antígeno
Definição: Proteína ou epítopo reconhecido pelo sistema imunológico e detectado pelo anticorpo.
Observação: Fixação inadequada pode mascarar o antígeno; recuperação antigênica pode ser necessária.
Artefato histológico
Definição: Alteração não natural no tecido causada por preparo ou manuseio.
Observação: Dobras, bolhas e precipitados podem interferir na interpretação.
Background (ruído)
Definição: Sinal inespecífico que não representa o antígeno.
Observação: Evitar lavagens insuficientes, bloqueio inadequado ou anticorpo secundário errado.
Bloqueio de ligação inespecífica
Definição: Passo que evita ligação não específica do anticorpo a proteínas do tecido.
Observação: Soro da mesma espécie do anticorpo secundário ou BSA é utilizado.
Capela de exaustão
Definição: Equipamento de segurança para reagentes tóxicos.
Observação: Manipular DAB, H₂O₂ e ácidos sempre dentro da capela.
Contracoloração
Definição: Coloração de fundo que destaca a morfologia celular.
Observação: Geralmente hematoxilina; não deve mascarar o sinal do cromógeno.
Controle negativo
Definição: Amostra que não contém o antígeno ou omite o anticorpo primário.
Observação: Avalia a especificidade do ensaio e descarta sinais inespecíficos.
Controle positivo
Definição: Amostra que deve apresentar reação positiva para o antígeno.
Observação: Garante que o ensaio funcionou corretamente; sempre incluir no lote.
Cromógeno
Definição: Substrato da enzima que produz coloração visível.
Observação: Ex: DAB gera marrom, AEC gera vermelho; escolha depende da contracoloração.
Desparafinização
Definição: Remoção da parafina antes da coloração.
Observação: Essencial para permitir penetração de anticorpos.
Diluição de anticorpos
Definição: Redução da concentração para otimizar sinal e reduzir background.
Observação: Testes preliminares (titration) ajudam a encontrar a melhor diluição.
End-point colorimétrico
Definição: Momento em que a reação enzimática é interrompida.
Observação: DAB fixado com água ou álcool; tempo de desenvolvimento controla intensidade.
Especificidade
Definição: Capacidade do anticorpo de se ligar apenas ao antígeno alvo.
Observação: Testada com controles negativos; alta especificidade evita falsos positivos.
Epítopo
Definição: Região específica do antígeno reconhecida pelo anticorpo.
Observação: Monoclonais reconhecem um único epítopo; policlonais múltiplos.
Fixação
Definição: Preservação da morfologia celular e do antígeno.
Observação: Formalina neutra 10% é padrão; fixação prolongada ou inadequada pode prejudicar detecção.
Fixação cruzada
Definição: Tipo de fixação que liga proteínas do tecido umas às outras.
Observação: Pode mascarar epítopos; recuperação antigênica geralmente necessária.
HRP (Horseradish Peroxidase)
Definição: Enzima conjugada a anticorpo secundário que reage com substrato cromogênico.
Observação: Produz coloração visível; sensível a luz e tempo de incubação.
Imunofluorescência (IF)
Definição: Variante da IHQ que usa anticorpos conjugados a fluoróforos.
Observação: Permite multiplexagem visual; requer microscopia com filtros adequados.
Incubação
Definição: Tempo em que anticorpos e antígenos interagem.
Observação: Temperatura e duração influenciam intensidade da coloração.
Lamínula
Definição: Pequeno vidro que cobre o corte histológico.
Observação: Protege a amostra e facilita observação; use meio de montagem compatível com cromógeno.
Localização subcelular
Definição: Determinação se o antígeno está no núcleo, citoplasma ou membrana.
Observação: Fundamental para interpretação biológica.
Meio de montagem
Definição: Substância que fixa lamínula sobre corte.
Observação: Resinoso (Entellan) ou aquoso (glicerina); escolha compatível com DAB ou AEC.
Microtomia
Definição: Corte fino do tecido (3-5 µm) para lâminas.
Observação: Cortes muito grossos dificultam penetração de anticorpos; cortes finos são ideais.
Multiplexagem
Definição: Detecção simultânea de dois ou mais antígenos em um mesmo corte.
Observação: Requer anticorpos de espécies diferentes e cromógenos distintos.
PBS-T
Definição: Tampão fosfato salino com Tween-20 usado para lavagem.
Observação: Remove anticorpos não ligados e reduz background.
Peroxidase endógena
Definição: Enzima naturalmente presente no tecido que pode reagir com o cromógeno.
Observação: Deve ser bloqueada (ex: H₂O₂) para evitar falsos positivos.
Precipitado de cromógeno
Definição: Depósito sólido que interfere na leitura do corte.
Observação: Filtrar soluções de DAB e evitar incubação excessiva.
Recuperação antigênica
Definição: Técnica para restaurar epítopos mascarados durante a fixação.
Observação: Pode ser por calor (microondas, autoclave) ou enzima; depende do antígeno.
Sensibilidade
Definição: Capacidade de detectar pequenas quantidades de antígeno.
Observação: Anticorpos policlonais geralmente mais sensíveis; monoclonais mais específicas.