ELISA: Fundamentos e aplicações na detecção de antígenos e anticorpos (Minicurso IntegraVet UFV 2025)

ATENÇÃO: O conteúdo deste site pertence à Universidade Federal de Viçosa.

Data: 10 de setembro
Horário: 8:00 às 12:00
Local: Laboratório de Microscopia, DVT/UFV
Objetivo: Capacitar os participantes a compreender, executar e interpretar ensaios de ELISA aplicados à medicina veterinária.
Equipe:
Elaine Nery de Araújo
Fabrício Luciani Valente
Contato: fabriciovalente@ufv.br

Bem-vindo(a)!
Seja bem-vindo(a) ao minicurso de ELISA: Fundamentos e aplicações na detecção de antígenos e anticorpos do IntegraVet UFV 2025)! Esta página contém informações essenciais para preparar-se para o curso, conduzir-se durante as aulas práticas e acessar materiais de referência sempre que necessário. Pense nela como seu guia rápido durante as atividades no laboratório.

1. Orientações Gerais para o Curso

O que levar: Jaleco limpo e roupas adequadas ao laboratório. Luvas descartáveis serão fornecidas.

Opcional: Vamos interpretar resultados a partir de simulações, por isso, você pode levar seu computador com Excel instalado (de preferência). Deixe salvo o arquivo .xlsx que utilizaremos para simular métodos de interpretação de resultados. Clique aqui para baixar. Se não puder levar, seu aproveitamento no curso não ficará comprometido.

Comportamento e organização: Mantenha a bancada organizada, evite contato com reagentes fora das áreas designadas e nunca consuma alimentos ou bebidas.

Segurança: Trabalhe com atenção, siga normas de biossegurança e higienize as mãos antes e depois das atividades.

2. Princípios do ELISA

O ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica que utiliza anticorpos para detectar e quantificar proteínas, antígenos ou anticorpos específicos em amostras biológicas.

Tipos de ELISA:
Sanduíche: Detecta antígenos usando dois anticorpos específicos.
Competitivo: Mensura quantidade de antígeno presente pela competição com um marcador conhecido.
Indireto: Quantifica anticorpos presentes na amostra usando um anticorpo secundário conjugado a enzima.

Componentes essenciais:
Placa de microtitulação
Anticorpos primários e secundários
Substrato enzimático (geralmente HRP + TMB)
Amostras biológicas
Soluções de lavagem e tampão

3. Exemplo de Protocolo de ELISA (Sanduíche)

Etapa 1. Coating (Revestimento da Placa)

Objetivo: Fixar o anticorpo de captura na superfície da placa.
Procedimento:
1. Diluir o anticorpo de captura em tampão de carbonato-bicarbonato (pH 9,6).
2. Adicionar 100 µL por poço e incubar overnight a 4°C.
3. Lavar com tampão PBS-T 3 vezes.

Etapa 2. Bloqueio

Objetivo: Evitar ligação inespecífica de proteínas.
Procedimento:
1. Adicionar 200 µL de solução bloqueadora (BSA 1-5%) por poço.
2. Incubar por 1 hora à temperatura ambiente.
3. Lavar 3 vezes com PBS-T.

Etapa 3. Adição da Amostra

Objetivo: Permitir que o antígeno presente na amostra se ligue ao anticorpo de captura.
Procedimento:
1. Adicionar 100 µL da amostra por poço.
2. Incubar por 1-2 horas à temperatura ambiente ou overnight a 4°C.
3. Lavar 3-5 vezes com PBS-T.

Etapa 4. Adição do Anticorpo de Detecção

Objetivo: Reconhecer o antígeno capturado.
Procedimento:
1. Diluir o anticorpo de detecção conjugado à HRP no tampão apropriado.
2. Adicionar 100 µL por poço.
3. Incubar 1 hora à temperatura ambiente.
4. Lavar 3-5 vezes com PBS-T.

Etapa 5. Desenvolvimento (Reação Enzimática)

Objetivo: Gerar sinal colorimétrico proporcional à quantidade de antígeno.
Procedimento:
1. Adicionar 100 µL de substrato TMB por poço.
2. Incubar 10-30 minutos, protegendo da luz.
3. Adicionar 50 µL de solução de parada (ácido sulfúrico 1N).

Etapa 6. Leitura da Placa

Objetivo: Quantificar o sinal.
Procedimento:
1. Ler a absorbância em 450 nm usando espectrofotômetro de microplacas.
2. Comparar com curva padrão para determinar concentração.

4. Interpretação de Resultados

Curva de calibração: Representa a relação entre concentração conhecida e absorbância.
Controle positivo e negativo: Garantem validade do ensaio.
Cut-off: Valor que distingue amostras positivas de negativas.

5. Dicas Práticas

Sempre preparar reagentes frescos ou armazená-los adequadamente.
Evite bolhas ao adicionar soluções nos poços.
Lave os poços corretamente para reduzir ruído de fundo.
Padronize tempos e temperaturas para reprodutibilidade.

IMPORTANTE: Como utilizar a micropipeta de forma correta!
Precisão: A micropipeta é mais precisa quando utilizada próxima ao valor máximo do seu alcance.
Controle da força e velocidade:
Primeiro estágio do êmbolo: aspirar o reagente.
Segundo estágio: dispensar o reagente.
Descarte do líquido: Só solte o êmbolo depois de retirar a ponteira do frasco ou microtubo.
Profundidade da ponteira: Evite que o líquido suba pela parte externa; cuidado para não puxar bolhas de ar.
Observação do volume: Execute a pipetagem olhando atentamente o líquido que entra e sai. Evite pipetar direto no rack se for microtubos.
Posição da mão: Segure a pipeta corretamente, com a mão fechada e o polegar controlando o êmbolo.
Homogeneização da reação: Faça movimentos “vai e volta” no primeiro estágio do êmbolo algumas vezes para misturar.
Uso com ponteira: Nunca use a micropipeta sem ponteira.
Leitura do volume: Olhe sempre de frente para o ajuste e o volume na ponteira, evitando efeito de paralaxe.
Ajuste de volume: Finalize o ajuste sempre no sentido horário; se estiver aumentando o volume, passe um pouco e depois volte para o valor correto.
Umedecimento da ponteira: Puxe e solte o líquido duas ou três vezes antes de aspirar para maior precisão.
Aspiração do líquido: Faça de forma vertical, preferencialmente no centro do líquido.
Líquidos viscosos: Após soltar o êmbolo, espere alguns segundos para que o líquido preencha a ponteira completamente.
Posição da pipeta: Nunca vire a pipeta, principalmente se houver líquido dentro.
Ponteiras com filtro: Tenha cuidado extra, pois podem afetar a aspiração e o volume.
Armazenamento: Sempre na vertical, com o êmbolo para cima, evitando que as substâncias que lubrificam internamente a pipeta se distribuam de forma não uniforme.

6. Glossário

Absorbância: Medida da quantidade de luz absorvida por uma solução em determinado comprimento de onda.
Anticorpo: Proteína que se liga especificamente a um antígeno.
Antígeno: Substância reconhecida pelo sistema imunológico.
Blank: Poço sem amostra, usado para calibrar a leitura do espectrofotômetro.
Controle positivo: Amostra que deve gerar sinal, usada para validar o ensaio.
Controle negativo: Amostra que não deve gerar sinal, usada para verificar especificidade.
Curva padrão: Série de concentrações conhecidas de um analito usada para quantificação.
Cut-off: Valor de absorbância que separa amostras positivas de negativas.
Detecção: Etapa do ELISA em que a presença do antígeno é visualizada via reação enzimática
Diluição: Redução da concentração de amostra ou reagente para adequar à faixa de leitura.
Ensaio: Experimento planejado para medir a interação antígeno-anticorpo.
Espectrofotômetro: Aparelho usado para medir a absorbância de soluções.
HRP (Horseradish Peroxidase): Enzima conjugada ao anticorpo que produz sinal colorimétrico.
Incubação: Tempo em que reagentes permanecem juntos para permitir interação antígeno-anticorpo.
Microplaca: Placa de múltiplos poços utilizada como suporte do ensaio ELISA.
Pipetagem: Técnica correta de manuseio de líquidos com micropipeta para garantir precisão.
Poço: Unidade individual da microplaca onde a reação do ELISA ocorre.
Substrato: Reagente que, em presença da enzima, gera mudança de cor detectável.
Tampão: Solução que mantém o pH estável durante o ensaio, podendo conter detergentes como Tween-20.
Tampão PBS-T: Solução salina fosfatada com Tween-20 usada para lavagem, evitando ligação inespecífica.
Wash (lavagem): Etapa para remover anticorpos ou reagentes não ligados, evitando falsos positivos.