Técnicas histológicas: Da coleta a análise microscópica (Minicurso IntegraVet UFV 2025)

ATENÇÃO: O conteúdo deste site pertence à Universidade Federal de Viçosa.

Data: 09 de setembro
Horário: 8:00 às 12:00
Local: Laboratório de Microscopia, DVT/UFV
Objetivo: Capacitar os participantes para as técnicas de preparo, coloração e leitura de lâminas histológica.
Equipe:
Eugênio Scolforo Louzada
Laryssa Oliveira Pinguelli
Mayara Pereira Lotério
Fabrício Luciani Valente
Contato: fabriciovalente@ufv.br

Bem-vindo(a)!
Seja bem-vindo(a) ao minicurso de Técnicas histológicas: Da coleta a análise microscópica do IntegraVet UFV 2025! Aqui você encontrará informações completas para se preparar, orientar-se durante o curso e acessar materiais de apoio sempre que precisar. Esta página funciona como guia de referência rápida durante suas atividades em laboratório.

1. Orientações Gerais para o Laboratório

O que levar: Jaleco limpo e roupas adequadas ao laboratório. Luvas serão fornecidas aos participantes para manipulação do material nas atividades práticas.

Comportamento e organização: Mantenha a bancada organizada, evitando contaminações e acidentes. Não consuma alimentos ou bebidas, nem utilize celulares durante a manipulação de amostras ou reagentes. Sempre higienize as mãos antes e depois das atividades.

Segurança: Trabalhe com bastante atenção durante as atividades práticas.

2. Exemplo de um protocolo de processamento histológico

Etapa 1. Fixação

Objetivo: Preservar a morfologia e composição química do tecido, prevenindo autólise e degradação bacteriana.
Material: Formol a 10% tamponado (solução formalina neutra).
Procedimento:
1. Retirar o tecido e cortá-lo em fragmentos finos (≤5 mm de espessura) para garantir penetração adequada do fixador.
2. Imergir o tecido completamente em formol, mantendo relação volume fixador:tecido ≥ 10:1.
3. Fixar por 24 horas à temperatura ambiente. 

Etapa 2. Desidratação

Objetivo: Remover a água do tecido, preparando-o para a clarificação e infiltração com parafina.
Material: Séries de álcool etílico (70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
Procedimento:
1. Transferir o tecido fixado para álcool 70% por 30-60 min.
2. Progredir para concentrações mais altas de álcool (80%, 90%, 95%) por 30 min cada.
3. Finalizar em álcool absoluto (100%) por 2 trocas de 30-60 min cada.

Etapa 3. Clarificação

Objetivo: Substituir o álcool por um agente miscível com parafina, tornando o tecido translúcido.
Material: Xilol ou substitutos.
Procedimento:
1. Mergulhar o tecido em xilol por 2 trocas de 30-60 min cada.
2. Verificar se o tecido ficou translúcido.

Etapa 4. Infiltração com parafina

Objetivo: Preencher o tecido com parafina líquida, conferindo suporte para corte fino.
Material: Parafina de ponto de fusão 58-60°C.
Procedimento:
1. Submergir o tecido em parafina líquida, aquecida, por 2-3 trocas de 30-60 min cada.
2. Certificar-se de que o tecido está totalmente impregnado.

Etapa 5. Emblocamento

Objetivo: Criar blocos de parafina para corte no micrótomo.
Procedimento:
1. Colocar o tecido impregnado em molde de inclusão preenchido com parafina líquida.
2. Deixar solidificar à temperatura ambiente ou em bandeja resfriada.

Etapa 6. Microtomia

Objetivo: Obter cortes finos (4-6 µm) para microscopia de luz.
Procedimento:
1. Ajustar o micrótomo, cortando fatias uniformes.
2. Colocar os cortes em banho-maria (~40-45°C) para esticar e depois transferir para lâminas de vidro. 

Etapa 7. Montagem e secagem das Lâminas

Objetivo: Preparar os cortes para coloração.
Procedimento:
1. Deixar a lâmina secar em estufa a 37-40°C por 30-60 min antes da coloração.

Etapa 8. Coloração Hematoxilina & Eosina (HE)

Objetivo: Diferenciar núcleo (azul-arroxeado) e citoplasma/matriz extracelular (rosa).
Procedimento:
1. Desparafinizar: mergulhar em xilol (2 trocas, 5 min cada).
2. Reidratar: passar por álcool absoluto, 95%, 80%, 70% e água corrente (2-3 min em cada etapa).
3. Hematoxilina: submergir por 5-10 min.
4. Lavar em água corrente.
5. Diferenciar em solução ácida fraca (opcional, 5-10 seg) se necessário.
6. Passar por água corrente.
7. Eosina: submergir 1-3 min.
8. Lavar rapidamente em água ou álcool 70% (dependendo do protocolo).
9. Desidratar rapidamente em álcool 95% e 100%, seguido de clarificação em xilol.

Etapa 9. Montagem Final

Objetivo: Proteger o corte para análise microscópica permanente.
Procedimento:
1. Aplicar uma gota de meio de montagem resinoso sobre o corte.
2. Cobrir com lamínula, evitando bolhas de ar.
3. Deixar secar completamente antes da observação.

3. Leitura e Interpretação de Lâminas

Princípios básicos: Lâminas representam cortes bidimensionais de tecidos tridimensionais. Observe núcleo, citoplasma, fibras e matriz extracelular.

Artefatos comuns: Bolhas, dobras, desprendimento do corte, precipitados de corantes.

Dicas práticas:

  • Comece com baixa ampliação para localizar estruturas, depois aumente para detalhes.
  • Compare cores e padrões com atlas histológicos e imagens de referência.
  • Reconheça metacromasia e contraste produzido por corantes específicos.

4. Histomorfometria

  • Técnicas quantitativas aplicadas à análise de tecidos.
  • Permite medir: densidade de fibras, área celular, espessura de membranas, entre outros.
  • Ferramenta essencial para estudos comparativos e científicos, integrando análise visual e quantitativa.

5. Biossegurança em Laboratório de Histologia

  • EPI obrigatório: Jaleco, luvas, óculos e máscara.
  • Reagentes perigosos: Formol, xilol, DAB, ácidos e agentes quelantes devem ser manipulados em capela de exaustão.
  • Manuseio de material biológico: Coleta, corte e fixação devem ser cuidadosos para preservar integridade e evitar contaminação.
  • Prevenção de acidentes: Atenção na microtomia, controle de temperatura na parafina, cuidado com bolhas e dobras, adesão correta do corte.
  • Descarte de resíduos: Biológicos, perfurocortantes e químicos devem ser encaminhados para descarte especializado.
  • Legislação e ética: Todas as práticas devem seguir normas legais e comitês de ética (CEP/CEUA).

6. Alguns exemplos de coloração

Hematoxilina e Eosina (HE)
Objetivo: Evidenciar de forma geral a morfologia dos tecidos.
Resultado: Núcleos basófilos em azul-arroxeado; citoplasma e matriz extracelular em tons de rosa a vermelho.

PAS (Ácido Periódico de Schiff)
Objetivo: Demonstrar glicogênio, mucinas neutras, glicoproteínas e polissacarídeos.
Resultado: Estruturas ricas em carboidratos coram-se em magenta/rosa-escuro; núcleo contracorado em azul.

Tricrômico de Masson
Objetivo: Diferenciar colágeno de fibras musculares e citoplasma.
Resultado: Colágeno em azul, músculo e citoplasma em vermelho, núcleos em preto.

Picrosírius Red
Objetivo: Evidenciar fibras colágenas, especialmente sob luz polarizada.
Resultado: Colágeno em vermelho brilhante ao microscópio de luz comum; birrefringência verde, amarela ou vermelha sob luz polarizada.

Oil Red O
Objetivo: Demonstrar lipídios neutros e triglicerídeos em cortes por congelação.
Resultado: Gotículas lipídicas em vermelho vivo; núcleos contracorados em azul.

7. Glossário comentado

Acidófilo. Estrutura com afinidade por corantes ácidos.
Exemplo/Observação: Citoplasma e proteínas da matriz extracelular coram-se em rosa ou vermelho com eosina.
Artefatos comuns: Cor variável ou fraca se o tecido estiver mal fixado ou desidratado inadequadamente.

Adesão de cortes. Tratamento da lâmina para garantir que o corte não se desprenda durante coloração ou manipulação.
Exemplo/Observação: Uso de silano, poli-L-lisina, gelatina ou albumina de Mayer.
Artefatos comuns: Desprendimento do corte, falha na coloração ou danos ao tecido.

Artefato histológico. Alteração na estrutura tecidual não natural, causada por processamento, coloração ou manuseio.
Exemplo/Observação: Dobras, bolhas, precipitados de corante, distorções.

Basófilo. Estrutura com afinidade por corantes básicos (positivos).
Exemplo/Observação: Núcleos e estruturas ricas em DNA e RNA coram-se azul ou roxo com hematoxilina.
Artefatos comuns: Núcleo pouco corado se fixação insuficiente ou corante degradado.

Biossegurança. Conjunto de práticas para proteger operadores, amostras e o ambiente.
Exemplo/Observação: Uso de EPI, manipulação correta de reagentes tóxicos e descarte seguro de resíduos.
Artefatos comuns: Acidentes com navalhas, inalação de vapores tóxicos.

Birrefringência. Propriedade óptica de estruturas que exibem cores diferentes sob luz polarizada.
Exemplo/Observação: Colágeno corado com Picrosirius Red.

Capela de exaustão. Equipamento de segurança que remove vapores tóxicos e inflamáveis do laboratório.
Exemplo/Observação: Manipulação de xilol, formol ou DAB dentro da capela.

Clarificação. Tornar o tecido transparente após desidratação, preparando para inclusão em resina ou parafina.
Exemplo/Observação: Uso de xilol antes da montagem.
Artefatos comuns: Opacidade ou áreas esbranquiçadas se incompleta.

Corante ácido. Corante aniônico que se liga a estruturas básicas (acidófilas).
Exemplo/Observação: Eosina cora citoplasma em rosa.
Artefatos comuns: Cor fraca se tecido mal fixado ou desidratado.

Corante básico. Corante catiônico que se liga a estruturas ácidas (basófilas).
Exemplo/Observação: Hematoxilina cora núcleos azul-violáceos.
Artefatos comuns: Núcleo pouco corado se fixação inadequada ou corante degradado.

Contracoloração. Corante de fundo que destaca a estrutura principal evidenciada.
Exemplo/Observação: Verde luz ou eosina usada junto com PAS ou tricrômicos.
Artefatos comuns: Pode mascarar a coloração específica se aplicado em excesso.

Corte histológico. Fatia fina de tecido obtida para observação microscópica.
Exemplo/Observação: Geralmente 4-6 µm para microscopia de luz.
Artefatos comuns: Dobras, pregas, cortes divididos, desprendimento do corte.

Cortes por congelação. Obtenção de cortes sem desidratação, preservando lipídios, enzimas e antígenos.
Exemplo/Observação: Oil Red O, imunofluorescência.
Artefatos comuns: Cristais de gelo, distorção tecidual.

Descalcificação. Remoção de sais de cálcio de tecidos mineralizados.
Exemplo/Observação: Ossos e dentes; evita danos à lâmina do micrótomo.
Artefatos comuns: Retração se prolongada demais. 

Diafanização. Tornar o tecido transparente após desidratação.
Exemplo/Observação: Uso de xilol antes da inclusão.
Artefatos comuns: Opacidade ou áreas esbranquiçadas se incompleta.

Efeito metacromático. Fenômeno em que corante muda de cor ao se ligar a certos componentes.
Exemplo/Observação: Azul de toluidina cora grânulos de mastócitos em roxo.
Artefatos comuns: Perda do efeito se desidratação for inadequada.

Fixação. Preservação tecidual imediata após coleta, prevenindo autólise.
Exemplo/Observação: Formol 10% para tecidos gerais.
Artefatos comuns: Retração celular, perda de morfologia ou autólise se insuficiente.

Hematoxilina. Corante básico que se liga a estruturas ácidas.
Exemplo/Observação: Núcleo cora azul-violáceo ou roxo.
Artefatos comuns: Núcleo mal corado se corante velho ou fixação inadequada. 

Histomorfometria. Técnicas quantitativas de análise de lâminas histológicas.
Exemplo/Observação: Medição de áreas, densidade celular, proporção de fibras.
Artefatos comuns: Valores imprecisos se cortes irregulares ou dobra de tecido.

Imuno-histoquímica. Uso de anticorpos para detectar proteínas ou antígenos em cortes.
Exemplo/Observação: Detecção de CD markers com DAB ou fluorescência.
Artefatos comuns: Coloração inespecífica, precipitado de corante, descolamento do corte.

Inclusão (Emblocamento). Infiltração do tecido com resina ou parafina para cortes finos.
Exemplo/Observação: Parafina a 58-60°C para microtomia.
Artefatos comuns: Distorção, retração ou opacidade se a penetração for incompleta.

Lamínula. Pequeno vidro colocado sobre o corte histológico para proteção e análise.
Exemplo/Observação: Lâmina 24 × 60 mm ou 26 × 76 mm padrão.
Artefatos comuns: Bolhas de ar, deslocamento do corte, arranhaduras.

Marcação inespecífica. Cor ou sinal em estruturas que não são alvo da coloração.
Exemplo/Observação: Pode ocorrer em imuno-histoquímica mal controlada.
Artefatos comuns: Pode dificultar a interpretação ou gerar falso-positivo.

Meio de montagem. Substância que fixa a lamínula sobre o corte.
Exemplo/Observação: Resinoso (Entellan®) ou aquoso (glicerina).
Artefatos comuns: Bolhas, opacidade, descolamento da lamínula.

Microtomia. Obtenção de cortes finos uniformes para análise.
Exemplo/Observação: Cortes de 5 µm com micrótomo rotativo.
Artefatos comuns: Dobras, pregas, cortes divididos, espessura irregular.

Montagem de lâminas. Fixação da lamínula sobre o corte, protegendo e preservando a amostra.
Exemplo/Observação: Uso de meios resinosos ou aquosos.
Artefatos comuns: Bolhas, descolamento do corte, perda de efeito metacromático.

Mordente. Substância que facilita ligação do corante ao tecido.
Exemplo/Observação: Alumínio ou ferro em certas colorações especiais.
Artefatos comuns: Coloração fraca ou irregular se usado incorretamente.

Parafina. Resina usada na inclusão de tecidos para cortes finos.
Exemplo/Observação: Necessita desidratação completa do tecido.
Artefatos comuns: Ressecamento, retração ou quebra do tecido.

Precipitado de corante. Depósito sólido de corante sobre o tecido.
Exemplo/Observação: Pode obscurecer estruturas; evitar filtrando corantes.
Artefatos comuns: Interfere na visualização celular ou extracelular.

Ressecamento tecidual. Perda de água durante preparo ou montagem que altera morfologia.
Exemplo/Observação: Causa retração ou distorção celular.
Artefatos comuns: Distorção, opacidade ou quebra de tecido.

Resina de montagem. Substância que sela cortes com lamínula garantindo permanência.
Exemplo/Observação: Entellan® ou Permount®.
Artefatos comuns: Bolhas, opacidade ou descolamento da lamínula.

Técnicas especiais de coloração. Métodos para evidenciar elementos específicos do tecido.
Exemplo/Observação: Picrosírius Red (colágeno), PAS (glicoconjugados), Oil Red O (lipídios).
Artefatos comuns: Cor fraca ou inespecífica se preparo inadequado.

Tricrômico. Coloração que usa três corantes para diferenciar componentes teciduais.
Exemplo/Observação: Masson (colágeno azul, músculo vermelho, citoplasma rosa).
Artefatos comuns: Sobreposição de cores ou contraste insuficiente se reagentes antigos.

Xilol. Solvente usado na clarificação de tecidos; tóxico e inflamável.
Exemplo/Observação: Preparação para montagem com meios resinosos.
Artefatos comuns: Retração tecidual, perda de lipídios, opacidade se usado incorretamente.